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T4多聚核苷酸激酶(T4 Polynucleotide Kinase，T4 PNK)是一种多聚核苷酸5'羟基激酶，可以催化ATP的γ位磷酸基团向单链或双链DNA、RNA、寡核苷酸或带有3'磷酸基团的单核苷酸的5'羟基转移。其它NTP也可产生相同的反应：5'-OH + NTP → 5'-P + NDP。

上述的磷酸化反应是可逆的。当缺失ATP并且存在ADP的情况下，T4 Polynucleotide Kinase可以显示出5'磷酸酯酶的活性，催化单链或双链DNA、RNA、寡核苷酸或带有3'磷酸基团的单核苷酸的5'磷酸基团向ADP的转移形成ATP。其它NTP也可产生相同的反应：5'-P + NDP → 5'-OH + NTP (最适pH为6.4左右)。

当ATP和ADP都适量存在时，T4 Polynucleotide Kinase可以催化单链或双链DNA、RNA、寡核苷酸或带有3'磷酸基团的单核苷酸的5'磷酸基团和ATP的γ位磷酸基团之间的交换反应。其它NTP也可产生相同的反应：5'-P + NTP + NDP → 5'-P + NDP + NTP。

T4 Polynucleotide Kinase同时具有3'磷酸酯酶活性，可催化3'磷酸化的多聚核苷酸的去磷酸化：3'-P → 3'-OH + Pi (最适pH为5.9左右)。T4 Polynucleotide Kinase的激酶活性在N-末端附近，而磷酸酯酶活性在C-末端附近。

• 寡核苷酸、DNA或RNA的5'末端标记，用作Southern、Northern、EMSA等的探针，凝胶电泳的marker，DNA测序引物，PCR引物等。
  
• 使寡核苷酸、DNA或RNA的5'端磷酸化，确保后续连接反应顺利进行。
  
• 催化3'磷酸化的单核苷酸的5'磷酸化，使该单核苷酸可以和DNA或RNA的3'末端连接。
  
• 去除3'端磷酸基团。

由大肠杆菌表达，表达基因的来源为T4嗜菌体。


一个活性单位是指在37℃条件下，30分钟内催化1nmol磷酸从ATP结合到5'-OH DNA所需的酶量。

组分	500U	2kU	10kU
T4多聚核苷酸激酶(10U/μL)	50μL	200μL	1mL
10×T4 PNK Buffer	150μL	500μL	2mL

保存：-20℃，有效期2年。


10mM Tris-HCl (pH7.4),50mM KCl,0.1mM EDTA,1mM DTT,0.1μM ATP,50% glycerol。


10×T4 PNK Buffer：
700mM Tris-HCl (pH7.6 at 25℃),100mM MgCl₂,50mM DTT。


不含DNA内切酶和外切酶，不含RNA酶。

• 75℃加热10min或65℃加热20min或可使T4多聚核苷酸激酶失活，加入EDTA也可使T4 Polynucleotide Kinase失活。
  
• 金属离子螯合剂、磷酸盐、铵根离子、大于50mM的KCl和NaCl均可显著抑制T4多聚核苷酸激酶的活性。

• 铵盐沉淀获得的DNA不能用于T4 Polynucleotide Kinase的标记反应。铵盐可强烈抑制T4 Polynucleotide Kinase的酶活性。
  
• PEG可促进磷酸化反应速率和效率；交换反应体系应加入PEG。
  
• 酶使用时宜存放在冰盒内或冰浴上，使用完毕后宜立即放置于-20℃保存。

图1.T4 Polynucleotide Kinase催化单链DNA 5'端磷酸化的效果图。使用本制品或N公司的T4 Polynucleotide Kinase，在50μL反应体系中加入图中指定量的T4多聚核苷酸激酶，37℃孵育30min进行反应，65℃孵育20min以终止反应。取出20μL反应液，用增强型ATP检测试剂盒检测反应体系中剩余ATP的浓度，根据反应体系中剩余ATP的浓度计算出反应体系中剩余ATP的量，根据反应体系中剩余ATP的量和初始加入的总量计算出反应体系中消耗掉的ATP量，消耗掉的ATP量可以反映T4 Polynucleotide Kinase的活性。以反应体系中加入的酶量为横坐标，消耗掉的ATP量为纵坐标作图。如图所示，本制品与N公司的竞品相比，具有类似的催化单链DNA 5'端磷酸化效果。反应体系(50μL):70mM Tris-HCl (pH7.6 at 25℃),10mM MgCl₂,5mM DTT,2μM ATP,2μM ssDNA，以及加入1μL不同浓度的T4 Polynucleotide Kinase。实际检测效果会因实验条件、检测仪器等的不同而存在差异，图中数据仅供参考。

• DNA 5'末端标记：
  
  • 参考如下表格设置反应体系：
    

    成分	用量
    DNA	1～20pmol
    10×T4 PNK Buffer	2μL
    [γ-32P or γ-33P]-ATP (3000Ci/mmol)	20pmol
    无核酸酶水	to 19μL
    T4多聚核苷酸激酶(10U/μL)	1μL

  • 按上表设置好反应体系后，轻轻混匀(可以用移液器吹打混匀或用Vortex在最低速度轻轻混匀)，随后离心沉淀液体。
    
  • 37℃孵育30min。
    
  • 加入1μL 0.5M EDTA (pH8.0)混匀，以终止反应。
    
  • 后续可以使用酚氯仿抽提、乙醇沉淀等方法纯化标记的DNA，也可以使用适当的DNA纯化试剂盒进行纯化。PCR产物DNA纯化试剂盒可以向百奥莱博订购。
• DNA 5'末端磷酸化：
  
  • 参考如下表格设置反应体系：
    

    成分	用量
    DNA	1～20pmol
    10×T4 PNK Buffer	2μL
    0.1mM ATP	1μL
    无核酸酶水	to 19μL
    T4多聚核苷酸激酶(10U/μL)	1μL

  • 按上表设置好反应体系后，轻轻混匀(可以用移液器吹打混匀或用Vortex在最低速度轻轻混匀)，随后离心沉淀液体。
    
  • 37℃孵育30min。
    
  • 加入1μL 0.5M EDTA (pH8.0)混匀，以终止反应。
    
  • 后续可以使用酚氯仿抽提、乙醇沉淀等方法纯化标记的DNA，也可以使用适当的DNA纯化试剂盒进行纯化。PCR产物DNA纯化试剂盒可以向百奥莱博订购。
• 其它用途可以参考上述用途或相关文献资料进行。

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